浙江微流纳米生物技术有限公司
脂质体作为新型药物载体，具有减少服药剂量，增加药物在体内的作用时间，提高治疗指数的作用。因此，将姜黄素(Curcurnin)制成载药脂质体，可以更好地发挥姜黄素的生物活性作用，明显改善其水溶性、增强靶向性。
姜黄素是从植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，是姜黄的主要活性成分。姜黄素有多种药理作用和良好的临床应用潜力。但是姜黄素本身也存在一些应用上的缺点，如姜黄素几乎不溶于水、极不稳定、易降解，因此限制了其应用。
纳米结构载药脂质体涉及药理学、生物药剂学、药代动力学和材料科学等诸多问题。设计和制备纳米结构脂质载体的大致思路如图 1 所示，具体为：前列步，确定药物；第二步，选择药物在体内的靶点、释放方式和服药途径，这些与药物的特性相关；第三步，确定载体的基材，药物和基材之间的亲和力对于设计载体的结构十分重要，亲和力强可以提高载体的载药能力。第四步，从结构和表面性能是否理想等方面评价纳米药物载体的制备方法，经质量检测后做出相应的调整，直至获得比较满意的制备方法。
图1 载药脂质体设计和制备方案流程图
任何一种新型给药系统对其原料及制剂的含量测定及质量控制，都需要建立一个新的准确、灵敏、可靠的分析方法。本文将介绍一个快速、灵敏的检测姜黄素脂质体的高效液相色谱-紫外检测方法。
主要仪器
高效液相色谱仪
磁力加热搅拌器
NanoGenizer20K高压均质机 苏州微流纳米生物技术有限公司
图2.高压均质机
主要试剂
姜黄素 美国 Sigma 公司
大黄素 美国 Sigma 公司
磷酸 美国 Sigma 公司
实验步骤与结果：
1.色谱条件：
色谱柱为 Thermo Hypersil ODS C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速为 1.0 mL/min，流动相为乙腈-0.5％磷酸水溶液(58：42)，检测波长为 423 nm，进样量为 20 μL，柱温为 30 ℃。
2.专属性实验：
1）对照品制备
取姜黄素标准品 1 mg，甲醇定容于 50 mL 容量瓶中，取适量稀释得 3.2 μg/mL的姜黄素标准品贮备液。取大黄素 1 mg，甲醇定容于 50 mL 容量瓶中，得 20 μg/mL 的大黄素内标溶液。
2）实验组样品溶液的制备
取姜黄素脂质体溶液 2 mL 于 10 mL 量瓶中，加入大黄素内标溶液100 μL，声破坏 5 min 后，以甲醇定容至刻度，再取适量于 10 mL 离心管中，4000 rpm 离心 10 min，取上层清液 2 mL 至 10 mL 容量瓶中，用流动相定容得姜黄素纳米结构脂质载体样品溶液，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后按上一步骤中的色谱条件进行测定。
3）空白脂质体的制备
取空白脂质载体溶液 2 mL，按照上述处理方式得空白纳米结构脂质载体对照溶液。
图3 A：空白 B：姜黄素、大黄素标准品 C：自制样品
比较 图3 中的 A、B、C 三图可知，样本中的内源物质不干扰姜黄素和内标大黄素的测定，本实验所采取的提取和测定方法的专属性良好。
3.标准曲线的绘制
精密吸取不同体积的姜黄素贮备液， 加入内标 20 μL，稀释成浓度分别为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.01μg/mL 的标准品溶液。按照上述色谱条件分别进样分析。
以标准品与内标峰面积积分比值(Y)为纵坐标，姜黄素检测浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线（图4）。得回归方程 Y=0.722X+0.0829 (R2=0.9998)。结果表明姜黄素在 0.01-3.2 μg/mL 的浓度范围内与峰面积积分比值呈良好的线性关系。
图4 标准曲线绘制结果
4.回收率实验
分别精密吸取不同体积的 3.2 μg/mL 的姜黄素标准品贮备液和相同体积的内标储备液于 10 mL 容量瓶中,以空白纳米结构脂质载体液定容，按上述步骤中所述方法配成姜黄素浓度分别为 0.05、0.8、1.6 μg/mL 溶液，按照上述色谱条件，每种浓度平行测定 5 次,计算平均回收率。
回收率是反映分析方法的准确度的标示，反映了在确定分析条件下样本浓度测定的准确性，一般样品的回收率在 85%-115%范围内。回收率实验的测定结果见表 1。由测定结果可知，平均回收率均在 99%以上，说明方法符合分析测定的要求。
表1 回收率实验测定结果
5.精密度实验
取上述姜黄素标准品溶液，每日测定 5 次，计算日内精密度；每日测定 1 次，连续测定 5 d，计算日间精密度。
精密度是指在确定的分析条件下，相同浓度的样品一系列测定值的分散程度，具体数值标示为相对标准差（RSD）。在样本的分析中，一般要求选择低、中、高 3 个浓度的质控样品同时进行分析方法的精密度考察。低浓度一般在仪器检测定量下限的 3 倍以内，高浓度一般接近于标准曲线的上限，中间选一个浓度。一般样品的精密度应小于 15%。精密度实验结果见表 2，由测定结果可知，三种浓度样品的日内 RSD 小于 3.2%，日间 RSD 小于 3.5%，该分析方法的精密度良好，符合分析要求。
表2 精密度实验结果
6.包封率和载药率的测定
采用速离心法测定包封率。将姜黄素纳米结构脂质载体溶液用无水甲醇稀释声混匀，置于 2.5 mL 离心管，11000 rpm 离心 15 min，用高效液相色谱测定得脂质中总姜黄素的含量。取相同体积的纳米结构脂质载体用 0.9%的 NaCl溶液（体积比为 5:1）漂洗以去掉附在纳米结构脂质载体表层上的游离姜黄素，18000 rpm 离心 30 min，上清用无水甲醇声溶解，置于 2.5 mL 离心管，11000 rpm离心 15 min，高效液相色谱测定得纳米结构脂质载体层中姜黄素的含量。药物的包封率（EE%）和载药率（LC%）可以下公式计算得到：
EE%=纳米结构脂质载体层中姜黄素的含量×100/脂质中总姜黄素的含量
LC%=纳米结构脂质载体层中姜黄素的含量×100/脂质总量
表3 包封率测定结果
本研究采用速离心法测定包封率。此法操作简单、快速且不存在药物的吸附问题，适于实验室中对物质的分离。采用速离心法对待测的姜黄素纳米结构脂质载体，包封率的测定结果见表 3。由结果可知，速离心法测定的纳米粒的包封率高、重复性较好。
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