浙江微流纳米生物技术有限公司
乳脂称为乳脂肪球(MFG)，宏观上由TAG为核心的小球组成，由乳脂肪球膜(MFGM)界面层来稳定。从乳液科学的角度来看，MFGM 具有独特的结构和成分，反映了MFG 在乳腺分泌细胞中生物合成过程。该膜厚度约为8 ~ 10nm，是含有PL 和蛋白的多层膜。在牛乳中，脂肪球的直径范围为0.1 ~ 15 μm，平均直径为3 ~ 4 μm。
目前普遍共识是，TAG 在粗面内质网中合成，积聚成富含TAG 区域，然后作为离散的脂滴释放到细胞质中，被极性脂质和来自内质网的蛋白质包被。这些细胞内脂滴间通过彼此融合而体积增长，以形成各种大小的细胞质脂滴，然后将其转运到上皮细胞的并从中分泌出来。在分泌期间，脂滴完全被乳腺上皮细胞的细胞双层膜包被，如图1 所示。
图1 乳脂肪球分泌和乳脂肪球膜成分示意图
哺乳动物乳汁是一种天然存在的复杂生物液体，是新生儿营养和免疫功能成分的主要来源。乳营养成分多样，是机体生命活动中重要的营养素之一，被称为是“较接近完美的天然食品”。动物乳（例如牛、水牛和山羊）也被转化为各种乳制品，供婴儿和成人食用。乳脂成分组成复杂，不仅为新生儿提供50 ~ 60%能量，而且是脂溶性成分的重要载体，例如类胡萝卜素和脂溶性维生素。
随着人民生活水平提高以及乳品和烘焙行业发展，常温牛乳、常温发酵乳、奶油、黄油和奶酪的摄入量呈增长趋势。由于可能存在的致病微生物风险，以及生乳天然MFG 的大粒径导致的容易乳析分层，为提高它们的安全性和稳定性，市售乳制品一般都经过多项加工处理以延长货架期，其中以加热和均质较为常见。这些MFG 的天然结构被加工处理显著改变。
基于食物结构对脂质消化和吸收影响认知的深入，研究者们越来越关注MFG 摄入后的理化稳定性。有必要结合MFG 在胃肠道内的变化，从消化过程中的理化和结构特性角度，阐释脂质消化机制。近几年一些研究采用体外模拟胃肠道消化模型来探究加工处理过程对MFG 消化过程的影响。有必要采用三段式体外消化模型，系统研究因加工而得到的不同结构MFG 在消化过程中如何变化，以及对脂质消化动力学的影响。
本实验旨在研究通过均质和加热获得的不同结构MFG 在胃肠道消化过程中的消化特性，采用三阶段胃肠道消化模型(包括口腔、胃、小肠三阶段)，探究均质和热加工处理对于MFG 消化过程中物理化学性质变化的影响。我们基于以下假设开展本实验，乳脂消化的初始速率和较终程度取决于MFG 的初始粒径大小和界面性质，这些性质受加工处理影响。
实验材料与试剂：
新鲜生牛乳购买自当地农场，乳脂含量为3.5%(质量分数)，实验前暂时于4°C 保存。
主要试剂：猪胃蛋白酶 (P7000，250U/mg)、猪胰脂肪酶(L3126，100 ~ 400U/mg)、猪胃来源粘蛋白、猪胆盐、尼罗红、异硫氰酸荧光素酯(FITC)、氯化钠、氯化钙、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠等
实验仪器：
微射流高压均质机(NanoGenizer30K，配金刚石互容腔 F20Y-RT)，美国Genizer公司，苏州微流纳米生物技术有限公司提供；
中试型小型杀菌设备，美国Micro Thermics 公司；
恒温振荡培养箱(Excella 24)，美国 New Brunswick Scientific 公司；
磁力搅拌器，瑞士IKA 公司；
磁力搅拌恒温水浴锅、电子天平购自瑞士Mettler Toledo 公司；
Mastersizer 激光粒度仪2000 和Zetasizer纳米粒度电位仪(Nano ZS)，英国Malvern 公司；
Nikon Eclipse 80i 激光扫描共聚焦显微镜，日本Nikon 公司；
pH-stat 自动电位滴定仪(835 Titrando)，瑞士Metrohm 公司。
实验方法：
1. 制备均质和均质杀菌牛乳：
将生牛乳于10,000psi 压力下通过Genizer微射流高压均质机，重复3 次，获得均质牛乳。均质过程中，金刚石交互容腔夹套连接冷却系统，以防均质样品过热。
图2 MFG 结构受不同加工方式影响示意图
将生牛乳通过中试用小型杀菌设备，均质机位于预热和较终加热模块之间，分别于72°C 加热处理15 s 和138°C 处理2 s，获得高温短时(HTST)灭菌均质乳和高温瞬时(UHT)灭菌均质乳。
2. 体外消化模拟方法
1） 模拟消化液准备
各阶段消化液成分见表1，模拟口腔液储备液(ASSS)可在4°C 储存一周。模拟胃液储备液(SGFSS)可在4°C 长期储存。模拟小肠液(SIF)可在室温长期存放。
表1 模拟口腔液储存组成
2）各阶段工作液组成和注意事项见表2。
表2 模拟消化液工作液配置方法
3. 各阶段模拟检测方法：
1）口腔阶段：
在实验开始前，用磷酸盐缓冲液(PBS，5 mM，pH 7.0)将样品的脂含量稀释到2%，获得初始待消化样品，前期研究已优化各阶段模拟消化液浓度适于2%含脂量。
取20 mL 初始待消化样品于37°C 预热10 min，然后加入20 mL 已预热的ASWS，调整混合体系pH 至6.8，然后将混合液放置于37°C 恒温培养箱100 rpm 振荡2 min，模拟口腔消化阶段。
2）胃阶段：
取20 mL 口腔消化产物与20 mL 已预热的SFGWS(终体系胃蛋白酶活性为400U/mL)混合，调整混合体系pH 至2.5，然后将混合液放置于37°C 恒温培养箱100 rpm振荡 2 h，模拟胃消化阶段。
3）小肠阶段：
取30 mL 胃消化产物，调整pH 至6.995 ~ 6.999，然后加入已预热的1.5 mL SIF 和3.5 mL 胆盐溶液，调整体系pH 至6.995 ~ 6.999。然后快速加入2.5 mL 已预热的脂肪酶溶液(24 mg/mL，终体系脂肪酶活性为64 ~ 256 U/mL)。37°C 条件下反应2h，模拟小肠消化阶段。设定体系为恒定pH 7.000，采用pH-stat 自动电位滴定仪监控体系反应过程中消耗NaOH 的量。
详细结果与讨论，请见下文。
更多详情请联系
 | 王经理 |
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