浙江微流纳米生物技术有限公司
近年来，肿瘤新型治疗策略备受关注。而抗肿瘤药物大多为非水溶性，且成药性差，不良反应较大，靶向作用不强，这些问题不利于肿瘤的治疗研究。因此，制定改善药物溶解性、靶向性、不良反应的新型治疗策略刻不容缓。2005 年美国 FDA 批准白蛋白结合紫杉醇纳米粒( ANPs/PTX) 注射混悬液上市后，白蛋白纳米粒作为靶向药物载体引起了广泛关注。作为一种新型蛋白载体，白蛋白纳米粒具有水溶性、生物相容性、生物可降解性及无毒性和无免疫原性等多种特性。肿瘤微环境中存在白蛋白的结合位点，可与药物结合形成复合物靶向作用于肿瘤部位，进一步延长药物体内循环时间，改善抗肿瘤药物成药性、毒性、溶解性等，诸多显著优势使其成为药物递送的理想候选物。另外，白蛋白是实体瘤生长过程中所需氨基酸和能量的主要来源，肿瘤细胞表面存在白蛋白结合受体 gp60，白蛋白纳米粒与 gp60 结合后，gp60 进一 步与一种细胞内小窝蛋白-1结合，引起细胞膜内陷产生转胞吞囊泡，使白蛋白纳米粒跨过内皮细胞，进一步与在大量肿瘤细胞中过表达的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白( SPAＲC) 结合，较终导致白蛋白纳米粒在肿瘤内的累积量增加。但是， 基于白蛋白的纳米递送系统通常血液循环稳定性较低，即在达到肿瘤靶点之前，纳米粒过早解离并提前释放药物。
1.白蛋白纳米粒制备工艺
白蛋白纳米粒常用制备方法有去溶剂化法、乳化法、热凝胶法、纳米喷雾干燥法等多种方法。但其中去溶剂法常需使用有毒的交联剂; 乳化法使用交联剂容易引起中毒的同时需去除油相和表面活性剂，且相较于其他方法制备的粒径偏大; 热凝胶法制 备温度高且不适合包裹热不稳定药物; 纳米喷雾干燥法通过振动网络技术，制备条件要求高，制备过程长且制备出的粒径大。近年来，关于白蛋白纳米粒制备工艺的研究日益广泛，现就以下几种新型制备方法进行阐述。
1.1纳米沉淀法
纳米沉淀法操作简单，广泛用于各种药物载体的构建，通常适用于包裹疏水性药物。 将白蛋白溶解在水中作为水相，药物和聚合物共同溶解在有机溶剂中作为有机相，聚合物形成纳米颗 粒的同时把药物分子包裹在纳米粒内部，较后将由水相和有机相组成的溶液混合均匀并蒸发去除有机溶剂，得到白蛋白纳米粒。
1.2高压流体纳米均质乳化法
将含有白蛋白的水相和含有疏水性药物的有机相混合，搅拌使其乳化。再将其置于高压流体均质机中，在适当压力下循环，较后减压蒸发去除有机溶剂，冻干得到白蛋白纳米粒。制备过程简单快速，但涉及有机溶剂的使用，可能会导致剂型不良反应的产生与增加，因此如何有效去除其中的有机溶剂是目前存在的主要问题。
1.3 微流控共流技术
去溶剂化法常以戊二醛等作为化学交联剂，毒性较大，残留试剂严重影响用药安全。该微流控共流方法基于去溶剂化法，为无需额外交联剂即可形成纳米粒的微流控共流策略。本方法代替逐滴添加，去溶剂化剂在微流控芯片中与蛋白质溶液相邻流动，混合速度较快，且去溶剂化剂的浓度不会逐渐增加。由于常规制备方法的局限性，包括批次间质量差异大和工业化放大可行性差等。纳米药物递送系统的工业转化速度较为缓慢， 而微流控技术对于流体的混合具有良好的可控性和重现性，能够突破常规制备方法的局限，加快纳米药物制剂的工业化和临床转化。
1.4 NabTM技术
NabTM技术是在没有任何常规表面活性剂或任何聚合物核心存在的情况下，以白蛋白作为基质和稳定剂，利用气穴空化作用瞬间打开白蛋白之间的巯基或二硫键，从而制备得到纳米粒。 利用高剪切力下( 声处理、高压均质等) 的气穴空化作用使白蛋白中巯基或二硫键瞬间断裂，同时有机溶剂快速挥发，快速包裹药物后白蛋白之间相互交联再次形成新的二硫键，从而将药物包裹至纳米粒内部。
2 白蛋白纳米粒表面修饰
白蛋白纳米粒作为抗肿瘤药物载体，具有众所周知的被动靶向机制［选择性高通透和滞留性 ( EPＲ) 效应］以及细胞内吞作用。目前药物在抑制肿瘤细胞增殖的同时，也会对正常组织器官产生显著的不良反应，因此提高药物的肿瘤靶向性、减少其 在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。白蛋白表面含有许多活性氨基可供结构修饰， 通过共价偶联改变表面性质，如与细胞特异性受体结合( 如生物素修饰靶向表面生物素受体丰富的肿瘤细胞、半乳糖化修饰提高肝靶向性、透明质酸修饰 提高药物在肿瘤部位的蓄积) 、免疫抗体偶联( 抗体- 抗原介导系统) 、亲水材料修饰［如通过聚乙二醇 ( PEG) 修饰提高亲水性，避开巨噬细胞的吞噬］等 途径可以实现抗肿瘤药物的主动靶向性。纳米粒可以较好的保护药物与配体不在体内被提前消除，从而延长了药物半衰期，肿瘤细胞内或表面存在结合受体，可与白蛋白纳米粒相应修饰配体结合，实现对肿瘤细胞的进一步靶向作用，且实现了药物的长效缓释。白蛋白纳米粒经表面修饰后靶向性增强，除此之外，甘草酸、甘草次酸、乳糖、精氨酰-甘氨 酰-天冬氨酸( ＲGD 肽) 、适配体和运铁蛋白等修饰也可以增强白蛋白纳米粒的靶向性。
2.1 生物素修饰
生物素( biotin) ，又称维生素H、 辅酶Ｒ，是一种水溶性维生素，含有氨基与羧基，通过化学偶联作用与白蛋白链接。经研究发现许多肿瘤细胞表面常过表达生物素受体，因此利用生物素修饰也可达到肿瘤靶向的目的。研究人员利用二硫键还原法制备了负载 PTX 的生物素牛血清蛋白 ( BSA) 纳米粒。结果显示 PTX 负载的 Biotin-BSA NPs 平均粒径为 163 nm，Zeta 电位为 － 35 mV。纳米粒呈球形，粒径分布集中。MTT 法检测细胞毒性显示 PTX 负载的 Biotin-BSA NPs 对生物素受体阳性 MCF-7 细胞的体外细胞毒性高于 PTX。流式细胞仪细胞摄取实验显示生物素受体介导的 Biotin-BSA NPs 具有内吞作用，极大增加了药物的肿瘤靶向性富集。
2.2 半乳糖化及透明质酸修饰
糖类化合物修饰大多以单糖和多糖类修饰为主，如半乳糖是某些糖蛋白的重要成分，在交联剂的作用下通过药物本身或其衍生物与白蛋白赖氨酸残基的游离氨基作用实现连接。研究人员以姜黄素( CUＲ) 为模型药物，制备了 CUＲ 负载的半乳糖化牛血清白 蛋白纳米粒( Gal-BSA NPs) 。结果显示纳米粒粒径为( 267.1 ± 78． 3) nm，Zeta 电位 － 42． 51 mV，EE 为 79.4% ，载药量为 3.7% 。体外释放实验结果显示 CUＲ 原料药在释放介质中释放较快，8 h 的释放量 近 100% ，而 Gal-BSA NPs 在 8 h 释药量仅为 20% ， 在 48 h 释药量 ＞ 80% ，Gal-BSA NPs 相比原料药 CUＲ 具有明显缓释特征。
透明质酸是一类天然多糖，是构成细胞外间质和细胞质的主要成分，利用透明质酸的羧基与白蛋白上赖氨酸反应，通过直接耦合 法形成偶联物。研究人员通过研究制备了 HA 包覆的阳离子白蛋白纳米粒( HNPs) ，同时负载疏水性 CLE 和 亲水性 1-甲基色氨酸( MT) ，平均粒径为 300 nm。在 HA 酶存在下，HNPs 粒径减小，以促进深入肿瘤组织。C57BL /6 小鼠移植瘤模型的生物分布研究表明，HNPs 的体内循环时间延长，在肿瘤部位蓄积增加。与 CLE 溶液相比，CLE 联合 MT 对异种移植和 原位胰腺癌小鼠模型的抑制肿瘤作用明显增强。
2.3 甘草酸( glycyrrhizinate，GL) 修饰
GL 又称为甘草甜素，为苷类化合物。就改善 ＲES 水溶性差，生物利用度低等问题，研究人员制备了由 GL 结合 HSA 包裹白藜芦醇纳米粒 GL-HSA-ＲES NPs。 GL-HSA-ＲES NPs 给药后 Cmax 值为( 933 ± 76. 64 )ng·mL －1 ，显著高于 ＲES 溶液( 618 ± 42． 54) ng·mL －1 ， 而达峰时间( Tmax ) 值为( 0.17± 0.01) h，显著低于 ＲES 溶液(0.25 ± 0.01) h。GL-HSA-ＲES NPs 组的 生物利用度是单独ＲES 组的4.25 倍，在其给药的 大鼠主要器官中 ＲES 的浓度远高于原料药 ＲES 处 理的大鼠，且 GL-HSA-ＲES NPs 组在大鼠肝脏中 ＲES 浓度较高，表明 GL-HSA-ＲES NPs 是一种可显著提高ＲES 体内生物利用度的肝靶向给药系统。
2.4 其他修饰
已有研究证明，在某些肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞上，常特异性地高表达某些整合素受体、抗原等，而许多蛋白质和抗体能与相关受体特异性结合，如 ＲGD 肽、单克隆抗体等。 表 1 总结了目前材料修饰白蛋白纳米粒在肿瘤靶向治疗中的研究。
4 总结与展望
虽然白蛋白作为药物载体的研究已经成为热点，但是其作为药物载体的制备以及相关药物新剂型的开发，仍存在一定的技术壁垒。白蛋白药物载体常规的制备方法，已经不能完全满足目前制剂高质量发展的需要。乳化法、NabTM制备方法已较为成 熟，但大都会涉及有机溶剂或交联剂的使用，可能存在毒性反应。因此如何避免化学交联剂的使用，以及保证有机溶剂的去除是当下白蛋白纳米粒制备工艺研究的热点，如瞬时纳米沉淀法中的闪蒸法、基于去溶剂法发展的可加速纳米药物递送系统工业转化的微流控共流技术等，有待进一步研究。白蛋白纳米粒作为一种新型药物载体，同时具有改善药物溶解性、增强药物靶向性、降低药物毒性以及增强药物疗效等多种特性。目前，其在难溶性抗肿瘤药物研究中尤其受到青睐。然而白蛋白作 为药物载体也有着自身的局限性，如白蛋白易变性、 成本较高、HSA 来源有限、BSA 用于注射存在轻度的免疫反应等，以及目前对于白蛋白纳米粒在肿瘤部位富集的主要机制尚不明确，如 EPＲ 效应或转胞吞作用还有待进一步研究。
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