纳米药物泛指具有纳米尺度的药物制剂。因具有增溶、减毒、促渗及延长循环时间等特性，在过去的几十年里，纳米药物在疾病诊断和治疗中引起了广泛关注。尽管纳米药物的出现和发展在体外和动物水平的研究中取得了重大进步，但在临床转化阶段仍面临着重大挑战。这是因为研究者们未 能充分理解纳米药物与生物系统之间的相互作用。

       纳米药物与生物系统之间的相互作用取决于纳米颗粒的物理化学性质，例如形态、粒径、粒径分布等表面性质。国家药品监督管理局药品审评中心和美国食品药品监督管理局的指南都要求对纳米药物进行全面表征，以确保其药效可控。然而如何对纳米级别的颗粒进行精确且全面的粒径表征仍然是一项巨大的挑战。因此，本文聚焦于纳米药物的粒径（包括与粒径有关的形状及粒径分布），概述现有检测方法，并通过对各方法分类进行比较，以期为纳米药物精确且全面的表面性质表征提供指导。

1 纳米药物

近几十年中，纳米药物发展迅速。相比于微米级颗粒，纳米级颗粒具有更小的粒径、更精微的形状以及更大的比表面积，材料多样可调，与生物系统之间的相互作用也大不相同。据国家药品监督管理局药品审评中心发布的相关指导原则所述，纳米药物的最终产品或载体材料的外部尺寸、内部结构或表面结构具有纳米尺度（100 nm及以下），或最终产品或载体材料的粒径通常在1000 nm以下，且具有明显的尺度效应。除了粒径以外，形状、电位、亲/疏水性以及结构等物理化学性质都会影响纳米药物和生物系统间的相互作用，进而调控其药效的发挥（图1）。

       自1964年纳米粒分类中脂质体结构的概念被首次提出，到80年代末粒径与纳米药物的高渗透长滞留效应的关系被报道，再到表面进行聚乙二醇（PEG）修饰的长循环脂质体 Doxil 的问世，关于纳米药物粒径及表面性质的探索从未停止。2020年mRNA 疫苗的出现更是让脂质纳米粒吸引了世界的目光，使人们对纳米药物与生物系统之间的相互作用产生极大兴趣。然而，对纳米粒进行精确且全面的表征和调控仍然是一项巨大的挑战，使纳米药物的临床转化具有一定困难。而这些问题的突破取决于表征方法的选择和更加先进的检测方法的开发。

图1 纳米药物的物理化学性质与生物系统之间的相互作用

2 粒径 

2.1 形状、粒径与粒径分布

纳米药物的形状和尺寸在体外水平上会影响纳米粒与活细胞之间的相互作用，体内水平上会 影响其分布与排泄过程（图2）。经比较MCF-7人乳腺癌细胞对不同形状纳米粒的摄取行为，发现杆状和蠕虫状纳米颗粒的细胞摄取率显著高于球形纳米颗粒（图2A）。实验人员构建直径在30~280 nm的一系列球形介孔二氧化硅纳米粒，发现HeLa 细胞对直径为50 nm的纳米粒显示出最高的细胞摄取（图2B）。通过调节纳米药物的尺寸，可以调控其肺沉积行为（图2C）或延长在血中的循环时间。纳米药物粒径过大时会被单核吞噬细胞系统和网状内皮系统快速清除，过小（＜10 nm）则会经由肾脏迅速排出（图2D）。

       通常用粒径作为表征纳米粒尺寸的重要参数，而多分散指数（PDI） 则被用于描述颗粒粒径分布的均匀程度。PDI是对数据进行双参数拟合计算得到的无量纲数字，范围在0~1，数值越小代表粒度越均匀、粒度分布越集中。一般认为纳米药物的PDI小于0.2 时，粒径分布较为良好。

图2 纳米药物的形状、尺寸与生物系统之间的相互作用

2.2 等效粒径

在使用粒径描述纳米药物的尺寸时，通常将其认为是大小接近的球形，而粒径则为该纳米球体的直径。这对于形状原本就接近于正球形的纳米粒来说是容易接受的，但对于棒状、蠕虫状等非对称形状的纳米粒，则需要先将其计算为等效的球体，进而得到等效粒径（EPD）。

当不对称纳米粒的某一物理特性与球形纳米粒相同时，可认为该球形纳米粒与其等效，例如等效体积径、等效沉速径以及等效电阻径等。不同粒径测定方法所得到的EPD存在差异。采用激光法、沉降法或电阻法测得的粒径通常分别为等效体积径、等效沉速径以及等效电阻径。在不同国家的监管框架中，在纳米药物的表征阶段需要选择基于不同原理的多种测定方法，才能较为精确、全面地确定粒径及粒径分布情况。

3 粒径的测定方法

粒径和粒径分布的结果决定了测试物是否为纳米粒，所以它们是纳米材料物理化学性质表征的 第一步。目前已有基于多种测定原理、运用不同测量装置的纷繁多样的粒径测定方法，本文对各种方法的检测原理进行简述，并对其进行分类比较，帮助研究人员选择并组合多种检测手段，以达到精确、全面表征粒径的目的。

3.1 按照测定原理分类

按照不同技术的测定原理分类，纳米药物粒径测定方法可分为图像法（显微镜法）、激光法（光散射法）、电阻法和基于不同分离技术的测定方法（包括沉降法、纳米流式细胞技术、场流分离技术）等，本文对各种方法下可以获得的纳米颗粒表征信息和方法局限性进行了总结（表1）。

3.1.1 图像法

图像法是指采用显微镜等装置采集纳米药物的图像信息，再通过计算机对图像进行处理分析，一般可用来表征纳米药物的形状和粒径（表1“图像法”及图3A）。但由于图像采集区域中仅包含小部分纳米粒，若要用于测定粒径分布，需多次采集图像获得具有统计意义的数据量。

电子显微镜（EM）是利用电子束、电子透镜代替光束、光学透镜成像的显微镜，使分辨率显著提高，包括投射电子显微镜（TEM）和扫描电子显镜（SEM） 等。EM 适用于检测固体样品，可以提供样品的二维投影信息，是表征纳米药物形状及粒径的良好工具。采用磷钨酸负染法对包载光敏剂的阳离子脂质体进行染色，通过TEM 的方法证明该纳米药物的粒径在50~100 nm，分布较为均匀。用SEM的方法对包载洛哌丁胺的脂质纳米粒进行表征，证明该纳米药物的粒径在200~300 nm。但EM无法从三维水平全面表征立体的纳米粒形状，而且样品需耐受电子束的能量。对于SEM法而言，制备样品时还需喷溅一层导电涂层，这会影响粒径测量的准确性。

荧光显微镜（FM）是基于荧光的激发、发射及采集的显微镜，包括共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、受激发射损耗（STED）显微镜等。尽管荧光显微镜的分辨率通常低于TEM，但它却可以实现多组分多色标记，反馈另一层面上更为丰富的信息。用AF655 和AF488 两种荧光探针分别标记脂质体的磷脂及PEG 组分，并通过CLSM 法表征其粒径及表面PEG 随时间的脱落情况。由于脂质体的荧光强度与表面积成正比，采用粒径已知的标准纳米珠进行校准后，即可计算得到脂质体的粒径结果。相比于CLSM，STED 的分辨率和对比度更高。对病毒颗粒（绿）以及其外壳上的包膜蛋白（红）分别进行荧光标记，并比较了CLSM 和STED的成像差异。结果显示CLSM法仅能模糊显示出病毒颗粒的大小在250~350 nm，而STED法可以精确呈现出病毒颗粒成熟过程中包膜蛋白从分散到聚集的变化过程，提供了更为详细的表面信息。

3.1.2 激光法

激光法是指当激光照射到纳米粒后，通过计算其经散射或衍射所产生的变化来计算粒径的方法。该方法通常可用来表征纳米药物的粒径和粒径分布（表1“激光法”及图3B）。

动态光散射（DLS）是纳米药物粒径检测中使用最广泛的方法，检测的是流体动力学粒径，并且可以快速测得粒度分布的结果。但它仅适用于检测粒径呈单峰或较为分散分布的样品，易忽视体系中粒径较小的颗粒.采用DLS 法证明包载光敏剂的阳离子脂质体粒径约为100 nm，PDI小于0.2，粒径分布良好。同时也可以发现对于相同纳米药物,采用DLS测得的粒径略大于TEM 法所得结果，这是因为TEM 法检测的是实际粒径（直接投影），而DLS法检测的是流体动力学粒径。

小角X射线散射（SAXS）是指当X射线经过纳米药物时，会在入射线旁小角度内发生散射，散射角大小与粒径正相关。相比于TEM 法，SAXS 的粒径检测结果更具统计学意义，但其分辨率低于TEM，通常需要连用其他表征技术以确保结果的真实性。

纳米颗粒跟踪分析（NTA）是基于光散射和布朗运动的纳米药物表征技术，可以在单颗粒水平上检测粒径并统计粒径分布。相比于DLS 法，NTA 在检测多峰分布样品时分离度更高，结果更接近真实。使用DLS 及NTA 法对表面修饰有透明质酸的阳离子脂质体的粒径进行全面测定，并展示了NTA 的关键帧图片、粒径分布情况以及3D结果图，证明该脂质体粒径在210 nm左右。

3.1.3 沉降法

在相同介质中，粒径不同的纳米粒沉降速度会有差异。一般而言，粒径越大的纳米粒沉降速度越快。沉降法便是通过检测纳米药物在一定介质中的沉降速度来计算其粒径大小（表1“沉降法”及图3C）。

离心液体沉降（CLS）表征的是纳米药物的流体动力学粒径，其结果取决于样品的分散性，是分离度较低的测定方法。此外，CLS 呈现的是集成平均的结果，无法区分单颗粒和团聚体。CLS包括密度梯度离心（DGC）和差示离心沉降（DCS）法等。DGC多用于纳米粒的分离和纯化，DCS 可通过测定纳米粒的沉降系数进而计算得到粒径及粒径分布信息。对DCS法在多峰纳米粒混合物粒径及粒径分布中的测定进行探究。首先制备粒径分布集的聚苯乙烯乳胶颗粒，并通过 TEM、DLS 以及 DCS 的方法全面表征，得到其粒径142~145 nm；之后基于该粒径已知的纳米粒构建了一系列粒子簇混合物，并证明DCS法可以精确高效地测得不同组分的沉降系数分布。

3.1.4 电阻法

电阻法是指借助于检测纳米粒通过检测孔时的电阻变化来计算其粒径的方法。该系统一般包括电极、电解液以及检测孔，当纳米粒通过检测孔时会挤占一定体积的电解液进而导致电阻变化，而变化的幅度与纳米粒的粒径成正比。该方法可用来表征每一颗纳米药物的粒径，在统计量足够时也可以得到粒径分布的结果（表1“电阻法”及图3D）。

可调谐电阻脉冲传感（TRPS）是一种逐粒子测量技术，而不是和DLS一样的集成平均结果。比较TRPS 和NTA 法在检测超顺磁性氧化铁纳米粒（SPIONs）粒径及粒径分布上的差异，发现在4种SPIONs的测定中，TRPS法测得的平均粒径均小于NTA法，粒径分布也更窄。

图 3　粒径的测定方法

3.1.5 其他

除上述方法外，还有一些基于其他原理的粒径检测方法。

纳米流式细胞术（FCM）是基于传统流式细胞术开发的适合于纳米药物检测的高检测限、高信噪比的测定方法，可检测到粒径低至50nm的纳米粒，是一种新兴的单颗粒水平表征技术。

原子力显微镜（AFM）是一种基于扫描探针的技术，可以提供纳米粒的三维信息。当扫描悬臂尖端越过颗粒表面，其垂直位移与纳米颗粒表面和悬臂之间的相互作用力成正比，借此便可对纳米药物表面进行成像.

共振质量测试-微机电系统（RMM-MEMS）是通过构建微流体流动回路，并在回路中设置机械悬臂状谐振器及检测器，当纳米粒经由回路流至悬臂尖端时，谐振器的共振频率会随着纳米粒质量的增加而降低。

场流分离（FFF）是 一种基于流体动力学和物质在流动场中分布差异的分离技术，近年来被广泛应用于纳米药物粒径检测领域。其核心优势在于能够对复杂体系中的纳米颗粒（例如纳米脂质体、聚合物纳米粒、胶束等）进行高分辨率分离，并结合检测器（例如多角度光散射检测器、紫外检测器、示差检测器等）实现对粒径分布的精确表征。较常用于分析纳米颗粒粒径分布的技术是非对称场流分离（AF4）和离心场流分离技术（CF3）。

表 1　各种粒径测定方法的原理、表征内容、代表技术以及局限性

4 总结与展望

对纳米药物的粒径进行全面而精准的测定是其研发与质量控制的核心挑战之一。当前，多种表征技术（例如DLS、TEM、NTA）已广泛应用于纳米药物的粒径分析，但单一方法往往难以全面反映其复杂的理化特性。集成式技术（例如DLS）操作快速简便，但易受多分散、异质性干扰；单颗粒技术（例如AFM、TRPS）可对单个纳米粒进行示踪，却面临通量低、样品制备复杂等问题。此外，不同粒径表征技术的测定原理及适用范围不同，对同一 样品的测定结果常常存在差异。所以在未来研究中需重点关注：一是各粒径测定技术联用与标准化。 结合不同原理的方法以弥补单一技术的局限性，并推动国际统一的检测标准建立；二是智能化与高通量。利用机器学习优化数据解析，提升单颗粒技术的检测效率。相信通过多学科交叉创新，未来有望实现纳米药物粒径测定的精准化与标准化，加速其临床转化与应用。

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