岩藻黄素又称岩藻黄质、褐藻黄素，是一种具有共轭双键，且含丙二烯和环氧烷结构的胡萝卜素类色素，广泛存在于各种海带、裙带菜、海洋植物、羊栖菜中，约占海带类胡萝卜素总量的60%。目前有关岩藻黄素的研究主要集中在岩藻黄素的提取及其功能特性的分析，诸多生物学活性如减肥、抗肿瘤、 抗高血压、调节血糖等已被证实。研究证明岩藻黄素能使结肠癌细胞诱导DNA断裂，使诱导细胞凋亡，从而抑制结肠癌细胞的增殖。岩藻黄素的良好生物活性使其备受关注，然而岩藻黄素不溶于水，易受光、热、高温、氧气等因素的影响而发生氧化降解。这些问题都极大地限制了岩藻黄素在 食品、医药以及其他领域的应用，如何提高岩藻黄素的稳定性和生物利用率是目前面临的主要问题。

纳米乳液是一种液相以液滴形式分散于第2相、粒径为20～500 nm、呈动力学稳定的胶体分散体系。与普通乳液相比，纳米乳液具有粒径小、稳定性高、比表面积大等特点，将其作为生物活性脂质、药物、香料、抗氧化物质等功能成分的传输系统，可以很大程度地改善其水溶性、稳定性，提高生物利用率。目前制备纳米乳液的方法大致可分为低能乳化法和高能乳化法，高能乳化法常借用高压均质机、微射流、超声等设备提供的高机械能将体系的分散相粒子进行破碎，而低能乳化法多通过转相法制备。高压微射流作为制备纳米乳液的主要方法，能在短时间内实现高速撞击、剪切、气蚀、瞬 时压降等综合作用，达到流体的细化、乳化、均质，获得超精细的均一流体，而均质条件、乳液组成和连续相性质则是影响纳米乳液理化性质的主要因素。

       本实验采用高压微射流制备水包油（油/水）型岩 藻黄素纳米乳液（FCNE）， 研究了均质条件、乳化剂类型和质量分数、乳化温度、 助乳化剂（甘油）对FCNE理化性质的影响，并考察了FCNE在不同的pH值条件下的稳定性，为制备稳定均一的FCNE、提高岩藻黄素的稳定性和生物利用率提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

        玉米油 当地超市；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯 （吐温80）、酪蛋白酸钠  上海Aladdin试剂有限公司； 十二烷基硫酸钠（SDS） 美国 Sigma公司；岩藻黄素（纯度≥99.3%） 北京三区生物技术有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

NaNoGenizer高压微射流 Genizer美国公司；Ultra Turrax T25高速分散机\RCT basic1恒温搅拌器 德国IKA公司；NICOMP 380ZLS粒度分析仪 美国PSS公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；BS 224S型 电子天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FCNE的制备

        0.02%（质量分数，下同）岩藻黄素溶于10%玉米油中，搅拌至充分溶解，然后分别加入不同质量分数（1%～8%）的乳化剂（吐温80、SDS、酪蛋白酸钠）， 预先混合加热至不同温度（25、50、75 ℃），持续搅拌加热40 min，然后用注射器逐滴滴入水相中（水相质量分数82%～89%，pH 7.0）中，混合搅拌1h后，采用高速分散机以7500 r/min转速剪切4min，制备得到粗乳液。粗乳液进一步采用微射流均质机通过不同均质压强（30～150 MPa）和均质次数（1～8 次）处理得到FCNE。

1.3.2 制备FCNE的影响因素

1.3.2.1 均质条件

         吐温80质量分数1%、乳化温度25 ℃时制备的粗乳液经过微射流均质机在30、60、90、120、150 MPa条件下分别处理1、2、3、4、5、6、7、8 次。

1.3.2.2 乳化剂类型和质量分数

        乳化剂（吐温80、SDS、酪蛋白酸钠）质量分数分别为1%、2%、4%、6%、8%，乳化温度25 ℃，制备的粗乳液在120 MPa条件下均质4 次。

1.3.2.3 乳化温度

吐温80质量分数分别为1%和8%，油和乳化剂混合， 分别加热至25、50、75 ℃，持续搅拌加热40 min后，滴加至水相中（pH 7.0），制备的粗乳液在120 MPa条件下均质4 次。

1.3.2.4 助乳化剂（甘油）质量分数

乳化剂（吐温80、SDS、酪蛋白酸钠）质量分数为1%，分别添加质量分数为10%、20%、30%、40%、50%的甘油至水相中，乳化温度25 ℃，制备的粗乳液在120 MPa条件下均质4 次。

1.3.3  FCNE理化性质分析

1.3.3.1 粒径和电位分析

将制备的FCNE用去离子水稀释100 倍，以避免多重散射的影响，采用激光粒度仪于室温条件下分析FCNE的粒径、粒径分布（多分散指数（PDI）、粒径分布图）和电位。

1.3.3.2  pH值稳定性

乳化剂（吐温80、SDS、酪蛋白酸钠）质量分数为 1%，将乳化温度25 ℃、120MPa条件下均质4次制备的 FCNE分装于4支试管中，分别调节pH值至3.0、5.0、7.0、9.0，于室温条件下密封避光保存5d后，测定FCNE的电位和粒径。

1.3.3.3 储存稳定性

以1%吐温80作为乳化剂、乳化温度25 ℃、120 MPa 条件下均质4次制备的FCNE，与相同质量分数同样处理方法溶解在正己烷-乙醇（1∶1，V/V）中的岩藻黄素，共同置于37 ℃条件下密封避光保存30d。每隔5d定期取样1 mL，以正己烷-乙醇（1∶1，V/V）萃取FCNE中的岩藻黄素，445 nm波长处分别测定吸光度，以正己烷-乙醇溶液作为空白，根据岩藻黄素标准曲线计算岩藻黄素残留量。

1.4 数据分析

所有实验均重复3次，采用Origin 8.0和SPSS 19.0对实验数据进处理，使用Duncan法比较平均值之间的差异性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 均质压强和次数对FCNE粒径的影响

表1 不同均质压强和次数条件下FCNE粒径比较

由表1可以看出，粗乳液（粒径d=9 031 nm）经过不同压强分别均质1次后，粒径减小至401、295、223、195、182 nm，表明微射流均质对粗乳液的粒径有显著影响。在同一压强条件下，随着均质次数的增加，FCNE粒径显著减小（P＜0.05），经过4～5次处理后再增加均质次数，此时FCNE粒径变化不明显，这是因为微射流均质1次并不能达到100%的效率，当FCNE多次通过交互容腔时，FCNE颗粒受到巨大剪切力、撞击和空穴效应等作用，从而使得FCNE粒径不断减小，而FCNE经过多次处理后，粒径基本达到“饱和”，此时增加均质次数不能无限减小FCNE的粒径。当均质次数一定时，随着处理压强的增加，FCNE粒径显著减小（P＜0.05），当压强达到120 MPa后，继续增大压强，FCNE粒径变化较小。综合考虑均质压强和次数对FCNE的影响，实验中选取120 MPa均质4次制备FCNE。

       PDI也是表明乳液稳定性的重要参数，PDI值反映了液滴的尺寸分布，PDI值越小，表明乳液粒度分布越集中。图1a、b分别是均质4次和压强为120 MPa时的粒径分布图，可以看出随着处理压强和次数的增加，FCNE粒径分布逐渐变窄，PDI值逐渐减小。

图1 均质压强（a）和均质次数（b）对FCNE粒径分布的影响

2.2 不同乳化剂类型和质量分数对FCNE粒径的影响

 目前，应用于食品中的乳化剂主要包括小分子乳化剂、磷脂、蛋白质和多糖等，不同乳化剂对纳米乳液的理化性质有显著影响。本实验考察了3种不同质量分数的乳化剂对FCNE粒径的影响。

图2 乳化剂类型和质量分数对FCNE粒径的影响

   图2显示，随着乳化剂质量分数升高，3种不同乳化剂（吐温80、SDS、酪蛋白酸钠）制备的FCNE粒径均减小，当乳化剂质量分数达到8%时，FCNE粒径分别为90、77、185 nm。这是由于乳化剂质量分数较高时，更多的乳化剂分子覆盖在油分子表面，油/水界面表面积增大， 乳化剂吸附速率加快，可防止小液滴间的重新聚合。 此外，吐温80和SDS制备的FCNE粒径明显小于酪蛋白酸钠制备的FCNE，主要原因是吐温80和SDS为小分子乳化剂，吸附到油/水界面速率快，而酪蛋白酸钠为大分子乳化剂，吸附速率慢；同时，吐温80和SDS分子结构较为紧凑，空间位阻作用小，容易在油水界面形成致密的乳化剂层，从而迅速降低界面张力，促进小液滴的形成，因而吐温80和SDS制备的FCNE粒径较小。 考虑到实验结果和乳化剂的实际添加量，实验中选取质量分数为1%的吐温80制备FCNE考察其储存稳定性。

2.3 乳化温度对FCNE粒径的影响

图3 乳化温度对FCNE粒径的影响

       从图3可以看出，当吐温80的质量分数分别为1%和8% 时，乳化温度由25 ℃升高至75 ℃，FCNE粒径分别由154 nm 和90 nm显著减小至122 nm和73 nm（P＜0.05）。这主要是因为随着乳化温度的升高，油相的黏度不断降低，油/水界面张力显著下降，有利于乳化过程的进行。同时，乳化温度升高将导致非离子表面活性剂分子的亲水头部脱水，几何结构和溶解性发生变化，进一步减小界面张力，促进乳化和小液滴的形成]。此外，乳化温度过高容易导致岩藻黄素的降解，因而实验中选取25 ℃制备FCNE。

2.4 添加助乳化剂（甘油）后FCNE粒径变化

图 4 甘油质量分数对FCNE粒径的影响

实际生产应用中，乳化剂的用量均有一定的限制，为了制备稳定的纳米乳液，可以添加适当的助乳化剂。研究表明添加助乳化剂可显著改善水相的黏度，直接影响到纳米乳液的性质。如图4所示，随着甘油质量分数的增大，FCNE的粒径均有所减小。可能原因是甘油质量分数的增加导致水相黏度增大，从而增大剪切压强，使得对液滴作用力增大；其次，黏度增加意味着液滴间碰撞频率减小，液滴重新聚合的机率减小。此外，甘油分子极性比水分子小，可以降低界面张力，促进乳化作用，形成均一稳定的FCNE。

2.5 pH值稳定性

图 5 不同pH值对FCNE Z-电位的影响

        如图5所示，当pH值在3～9范围内时，吐温80制备的FCNE电位变化较小，这主要是因为吐温80为非离子型乳化剂，受pH值影响较小。而SDS为阴离子型乳化剂，分子中的OSO₃^- 电离使得FCNE液滴表面带负电荷，当pH值由3增大至9时，Z-电位相应从－12.1 mV显著降低至－66.9 mV（P＜0.05）。酪蛋白酸钠属于两性离子型乳化剂，等电点约为pH 4.6，当 pH＜4.6时，NH3 ^＋使得FCNE液滴表面带正电荷；相反，当pH＞4.6时，COO^－使得FCNE液滴表面带负电荷，当pH 4.6时，FCNE液滴表面电荷基本为零。对图5中的Z-电位进行分析可知，SDS和酪蛋白酸钠制备的FCNE易受pH值的影响，而吐温80制备的FCNE在不同pH值条件下较稳定。

2.6 储存稳定性

图 6 FCNE的储存稳定性

图6A为纳米乳液包覆的岩藻黄素与同质量浓度的溶解在有机溶剂中的岩藻黄素在37 ℃条件下储存，岩藻黄素残留量随时间的变化趋势。从图6A可以看出，溶于有机溶剂中的岩藻黄素含量随储存时间的延长迅速降低，储存20d后，岩藻黄素残留量仅为5%，25d后，岩藻黄素残留量为零。相比之下，纳米乳液包覆的岩藻黄素降解缓慢，由初始状态（93%，均质导致的少量损失）储存30d后残留的岩藻黄素仍处在较高水平，为32%。对比储存过程中的颜色变化则更加明显，如图6B所示，可以看出，储存30d后，溶于有机溶剂的岩藻黄素基本变为无色，主要原因是岩藻黄素不稳定，对温度较为敏感，易发生降解，而纳米乳液包覆的岩藻黄素由棕红色变为浅黄色（图中未显示颜色），表明将岩藻黄素制成FCNE后，稳定性显著增强。

3 结论

本研究采用高压微射流制备油/水型FCNE并研究了均质条件（压强、均质次数）、乳化剂类型和质量分数、乳化温度、助乳化剂（甘油）对FCNE理化性质影响。研究结果表明：增大均质压强和均质次数有利于减小FCNE粒径，形成均一稳定的FCNE；适当升高乳化温度可减小乳液黏度及油/水界面张力，从而加速乳化进程；小分子乳化剂如SDS和吐温80制备的FCNE比大分子乳化剂（酪蛋白酸钠）制备的FCNE粒径更小（SDS＜吐 温80＜酪蛋白酸钠），主要是因为小分子乳化剂吸附油水界面的速率更快；不同质量分数的助乳化剂（甘油）加入到连续相中可以减小FCNE粒径，因而在乳化剂用量受到限制时，可适当添加助乳化剂。添加不同质量分数的甘油后，吐温80和SDS制备的FCNE粒径显著减小，而酪蛋白酸钠制备的FCNE粒径变化较小，表明SDS和吐温80制备的FCNE比酪蛋白酸钠制备的FCNE对水相黏度变化更敏感。此外，吐温80（非离子型乳化剂）制备的FCNE可在酸碱条件下稳定，而SDS（阴离子型乳化剂）和酪蛋白酸钠（两性型乳化剂）制备的FCNE对pH值变化较为敏感，因而采用非离子型乳化剂制备的FCNE具有较好的pH值稳定性，可适应消化道（如胃和小肠）内的不同pH值环境。实验中的FCNE在37 ℃条件下储存30d后，残留的岩藻黄素明显高于溶解在有机相中的岩藻黄素，表明纳米乳液可以显著提高岩藻黄素的储存稳定 性。高压微射流作为一种绿色安全的物理手段，将岩藻黄素制成FCNE，对制备岩藻黄素新剂型，提高岩藻黄素的稳定性及生物利用率具有积极意义。

高压微射流均质机

CHEN251013