浙江微流纳米生物技术有限公司
疫苗可有效预防人类部分传染病，但传统疫苗制备工艺复杂，在体内免疫原性较差或易恢复毒性，影响疫苗免疫效果且存在安全隐患，如19世纪末的减毒灭活疫苗、20世纪中叶的类毒素疫苗、20世纪70年代采用分子技术制备的基因重组疫苗等。随后，人们逐渐研发出新型疫苗，以提高对疟疾、结核病及艾滋病等疾病的预防效果及应对新型轮状病毒和冠状病毒等的传播。近年，有研究采用分子生物学方法将病原体的多肽蛋白或核酸整合至载体上，构建新型疫苗，其中，纳米材料由于其尺寸小、结构稳定、表面积与空腔体积大、表面可修饰、可保护传递多种抗原高效作用于靶细胞，且在人体中还具有安全低毒、传递效率高、免疫原性强等优点，已成为纳米疫苗制备中的常用载体。
1 纳米疫苗的优势
采用纳米材料作为疫苗载体可保护抗原以免被吞噬细胞降解，并可与靶细胞表面特异性受体结合，从而减少抗原脱靶率，提高传递效率。如自组装的蛋白质纳米粒子可通过设计合适的位点与靶细胞特异性受体结合，大幅减少脱靶现象。纳米疫苗可将核酸或抗原封装在纳米颗粒内部，直接被抗原呈递细胞（APCs）吞噬至胞内，避免被降解，还可通过纳米载体材料的尺寸、电荷和表面成分不同控制抗原释放的速度和环境，大幅提高免疫反应效率。如乙酰化葡聚糖纳米颗粒可将抗原递送至树突状细胞（DCs），在弱酸性条件下（pH 5）快速分解，显著增强MHCⅠ的呈递作用，精确调控细胞内抗原释放速率，以促进抗原呈递。
与传统疫苗比较，纳米载体也显现出了作为佐剂的潜力，传统疫苗多采用疫苗与佐剂（明矾、弗氏完全佐剂等）组合的方式激活体内的免疫反应，但会在体内形成局部积累，这可能引起非必要的炎性反应，且具有一定生理毒性，不宜应用于人用疫苗，而纳米疫苗中部分纳米载体材料具有高生物相容性、低毒性和可降解性，避免产生体内副作用，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物［PLGA］的乙醇酸成分或阳离子脂质体均可诱导产生免疫反应，具有作为纳米疫苗佐剂的潜力。另外， 纳米载体材料的多样化也丰富了疫苗剂型，由于其尺寸较小，可突破黏膜屏障，具有进行鼻腔疫苗接种的可行性，还可作制备乳剂、气雾剂等，方便多种人群多种方式的接种。
2 纳米疫苗载体材料的研究进展
目前，已有多种纳米载体材料，如蛋白质、脂质、聚合物或无机物，用于新型纳米疫苗的研发。
2.1蛋白质／肽纳米颗粒
基于蛋白质或肽作为载体的纳米疫苗可携带抗原，并增强抗原与APCs特异性受体的相互作用，以提高抗原免疫效应，且蛋白纳米颗粒生物相容性强，不易引起免疫排斥反应，可有效降低机体毒性，蛋白质／肽序列可进行定向修饰及精准调控，但免疫反应持续时间短，生产与保存成本较高。
重组病毒样颗粒（VLPs）由病毒衣壳蛋白自组装形成，可模拟天然病毒但不含遗传物质，无法复制，更安全，且重组表达的病毒衣壳蛋白更完整，有效保留了抗原的免疫原性 。如人乳头瘤病毒（HPV）疫苗，是由重组HPV外壳蛋白与佐剂组成，接种后可有效减少生殖器疣和宫颈癌的发病率。VBI Vaccines公司研发了第三代乙肝疫苗 PreHevbrio，并已获批上市，该疫苗 是一种含有乙肝病毒（HBV）Pre-S1、Pre-S2和S表面抗原的重组VLPs，免疫原性更强，经2～3次接种后可引发强烈的血清保护作用。一种新型的疟疾疫苗 MosquirixTM是以HBV表面抗原自组装的VLPs为载体，装载环子孢子蛋白（CSP）抗原，并以包含脂质体的AS01为佐剂，该疫苗可增强免疫系统的呈递作用和T细胞的免疫效应。CpG基序G10是一种Toll样受体9（TLR-9） 激动剂，目前，有研究采用噬菌体 Qbeta VLPs 包装 QbG10，制备治疗过敏性哮喘的新型疫苗，该疫苗已进入Ⅱ期临床试验阶段。VLPs的表面可进行多样化修饰，装载多抗原，引发高效免疫反应，如在鼠伤寒沙门菌 VLPs 中装载呼吸道合胞病毒（RSV）的两种蛋白抗原，接种小鼠后可引发特异性CD4和CD8T细胞免疫反应，RSV攻击后，CD8T细胞免疫反应显著增强。
2.2 脂质纳米颗粒
纳米疫苗中研究最为广泛的是脂质纳米颗粒，由两亲性双层磷脂和亲水核心构成球形囊泡，与其他纳米颗粒比较，脂质纳米颗粒的生物可降解性和生物相容性更高，具有更强的耐受性、渗 透性和流动性，还可提高疏水性抗原的溶解度。与蛋白质纳米颗粒相似，脂质体纳米颗粒的免疫反应也受其尺寸、电荷、免疫原性等因素影响。脂质体纳米颗粒的尺寸大小影响免疫效应的激活，约100 nm的脂质体纳米颗粒更易激活Th2 型免疫反应，而> 400 nm的则更易激活Th1型免疫反应。阳离子脂质体可封装带负电荷的抗原，且表面正电荷有利于与DCs带负带电荷的表面相互作用，促进抗原的呈递和增强免疫反应。用阳／阴离子脂质体封装抗原对小鼠进行免疫后，发现阳离子脂质体可引发比阴离子脂质体更强的Th1型免疫反应，通MHCⅠ途径促进抗原加工和积累。不同相变温度（Tc）磷脂组成的脂质体对免疫反应的影响也不同，用含利什曼病抗原rgp63的脂质体免疫小鼠，含高Tc磷脂的脂质体倾向于激活Th1型免疫反应，含低Tc磷脂的脂质体倾向于激活Th2型免疫反应。
脂质体还可作为佐剂用于疫苗的制备，有更强的免疫效应，且表面具有可修饰性 。自发现含磷酸二丁酯（DBP）的负离子脂质体可激活白喉类毒素更强大的免疫反应后，对脂质体作为佐剂开展了多项研究，如在疟疾、SARS-CoV-2等泛冠状病毒相关疾病、带状疱疹、腹泻、结核病、脑膜炎和乳腺癌等疫苗的临床试验中均有所应用。脂质体还可与聚合物交联形成复合纳米颗粒，在脂质体中加入聚乙二醇（PEG）可延长注射部位抗原驻留时间，缓慢释放抗原，延长免疫时间。有研究发现，加入10% PEG的脂质体在早期免疫反应中，细胞应答类型倾向于从Th1 型转换为Th2型 ，但使用PEG诱导的抗体在人体中易产生过敏现象。
2.3聚合物纳米颗粒
聚合物纳米颗粒具有生物相容性高、可降解性强、易于制备、系统毒性低、可工程化设计、表面可修饰等优势，将抗原与佐剂通过多种方式（溶解、封装、吸附）结合，可提高传递效率，减少脱靶情况。但高度集中的聚合物在人体中具有粒子聚集和潜在毒性的风险。
有机聚合物由于其制备方法简单，可进行工程化设计制备成所需尺寸、电势和形状的载体，并对表面性质进行微调控。常用的有机合成聚合物有PLGA、支链聚合物和阳离子聚合物。用于疫苗生产最常见的有机纳米颗粒为PLGA，由2个α⁃羟基乳酸和羟基乙酸组成，在生物体内可进入三羧酸循环被吸收。有研究表明，PLGA可装载多类型的抗原与佐剂，在体内进行交叉免疫反应，如针对AIDS、黑色素瘤、小鼠巨细胞病毒(MCMV)呼吸 道感染、炭疽杆菌感染、乙肝和破伤风等疾病的研究 。支链聚合物中研究最多的是树状大分子，由直径5～10 nm的长链排列成球状大分子，可在表面及内部分支处结合抗原与佐剂，通过控制核心、树枝及表面官能团改变纳米粒子的性质。常用于疫苗研 究的树状大分子有聚酰胺基胺（polyamide amine， PAMAM）、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺等。使用修饰后的树状大分子携带埃博拉病毒、H1N1型流感病毒或弓形虫编码抗原的mRNA 分子，均可在小鼠中产生良好的免疫反应 。研究发现，使用DNA-聚N-异丙基丙烯酰胺技术可于37 ℃保存mRNA长达约7 d，这使DNA⁃PNIPAM技术成为疫苗治疗肿瘤的新方向。阳离子聚合物纳米颗粒的优势在于可与带相反电荷的抗原结合，并于质子化过程中在细胞膜表面产生瞬态孔，有利于纳米粒子及抗原的进入，提高抗原呈递效率。阳离子聚合物聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）与卵清蛋白制备的纳米粒子免疫小鼠，可在小鼠体内产生特异性抗体。
2.4无机物纳米颗粒
无机材料具有结构稳定、可 重复性极高及与抗原结合简单的优势，虽然其生物 相容性和生物降解性较低，可通过物理或化学的方 法进行改造，改善其特性，但无机材料可在体内积 累，应重视其潜在毒性。
金纳米粒子可通过巯基高亲和特性对其表面进行修饰以改善生物亲和性，其本身具有的免疫特性也可在疫苗中直接作为佐剂，如可应用于AIDS、流感、疟疾和肿瘤疫苗的研究，且已有报道发现，金粒子纳米颗粒球形比杆状诱导的免疫效应更强。除金属单质外，金属氧化物也是无机纳米粒子的常用材料，如氧化铁已应用于黑色素瘤、疟疾等疫苗的研发中，磁性氧化铁纳米颗粒与肿瘤相关碳水化合物抗原TACA 糖肽通过疏水相互作用结合，免疫小鼠后，能产生可识别肿瘤细胞的抗体。非金属氧化物中，二氧化硅具有结构稳定、易于合成、高生物相容性和易改造的多孔结构的优势，可携带多种类型抗原和佐剂，且颗粒表面也可通过硅烷醇基团结合多种活性分子改善生物特性，增强免疫原性。在口服型乙肝疫苗及猪圆环病毒2型、牛病毒性腹泻病毒疫苗中均有应用。
目前，已获上市批准及处于临床试验中的新型 纳米疫苗的相关信息见表1。
3 小结与展望
传染性疾病和肿瘤等重大疾病依旧是人类生命安全的巨大威胁，虽然现代医学治疗手段已大幅提高患者生存率，但病原体的变异性和肿瘤的异质性对传统医学的预防和治疗方法提出了更高挑战，因此新型疫苗的开发迫在眉睫。纳米疫苗作为重要研究领域之一，在研究过程中已展现出了巨大潜力： ①免疫原性强，既可作为抗原载体又可作为佐剂，并可携带多抗原靶向免疫；②封装抗原可减少抗原降解和精准调控抗原释放，延长免疫时间，促进免疫记忆的形成，减少接种剂量与次数；③生物相容性高，材料特性多样化可与传统预防或治疗方式相结合，组合使用提高免疫效果。尽管纳米疫苗在研究中取得巨大进展，但在进入临床应用前仍面临诸多挑战：①特异性结合APCs等免疫细胞，易触发细胞负调节和免疫抑制信号 ；②多数相关研究结果集中在动 物模型，与人的临床效果有所差异，且对人体的副作用也难以用动物实验预测，如皮下给药导致的皮肤疾病、口服导致肠胃系统疾病、鼻腔给药导致呼吸系统问题等；③在放大生产中无菌处理和保存运输成本较高。基于上述问题，纳米疫苗的临床应用尚需深入研究。
除了对广泛性纳米疫苗的研究，纳米疫苗在个性化医疗上也具有巨大潜力，有研究发现，肿瘤细胞膜包裹的纳米颗粒对肿瘤细胞生长具有强烈的抑制作用，针对患者可直接从切除的肿瘤细胞收集抗原，制成仿生纳米颗粒再注入患者体内，促进肿瘤特异性免疫；抗菌疫苗可将菌株细胞外膜覆盖至纳米粒子上形成复合物进行接种，可有效防止细菌定植，并降低导致抗生素耐药性的直接选择压力，由于膜覆盖工艺简单，可基于此开发出多种纳米类疫苗，实现肿瘤治疗个性化疫苗研发。虽然目前仅有少部分纳米疫苗处于临床研究阶段，但随着该领域的不断研究和发展，未来有望研发出更安全有效的新型纳米疫苗。
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