浙江微流纳米生物技术有限公司
基因疗法在治疗由基因表达缺陷引起的疾病上有巨大的潜力。其较常用的实施方法即将治疗性遗传物质注入细胞,通过恢复或改变基因表达水平来建立蛋白质水平。高基因转移效率、可控无毒的传递载体、接受传递细胞的组织特异性均是基因疗法中需要克服的难点所在。
图1 发行文首页
聚乙烯亚胺(PEI)能将DNA缩合成纳米复合物(多聚体)以促进内吞,且PEI一旦进入细胞就表现出良好的质子海绵效应、缓冲作用和膜裂解能力,有利于多聚体的内体逃逸,是一个极好的非病毒基因载体。但是,由于其高电荷密度导致PEI/DNA复合物具有不稳定性和毒性,且缺乏基因靶向转移能力,使其在临床的应用被大大限制。
本文通过研究不同分子量聚乙烯亚胺(PEI30k,PEI70k)在不同质量比下的 DNA 聚合能力,以及PEI/DNA复合物的转染效率,确定了制备CPDcscpdc 制剂的PEI/DNA的较佳质量比为2.5/1(PEI30k/DNA)和0.75/1(PEI70k/DNA)。由于PEI70k/DNA 转染效率较高,可能适合作为高效转染载体制备。
通过对EE值的变化的观察,确定了较佳反应条件:293T-CP30Dc和293T-CP70Dc的质量比分别为2/2.5/1和2/0.75/1,挤出次数为15次。
基于以上结果,本文进一步研究发现:PEI/DNA复合物的粒径在CM封装后并没有明显改变。CM封装在有效降低同源CPDcs的细胞毒性,甚至能促进细胞增殖的同时,仍可以有效地释放游离DNA,且具有保护DNA不被核酸酶水解的能力。
即使CPDc在加入ECM后 ,粒径也没有明显增大,还能显著促进CPDc与细胞的粘附,可能增强CPDc与细胞的粘附,从而提高同源性的CPDc的摄取和转染效率。
在以上研究过程中,CPDcs的制备是利用脂质体挤出器将CM和PEI/DNA混合物通过孔径为200nm的聚碳酸酯膜挤出而得。ECM-CPDc的制备亦是利用脂质体挤出器将CPDcs与相应的ECM混合挤出而得。
图2脂质体挤出器的应用
脂质体和lipopolyplex用于药物,蛋白和基因给药系统。通过对多层脂质混合物的挤出,脂质体挤出器用来生产单层脂质体和lipopolyplex挤出是采用温和的压力小于3,000psi一步制备单层脂质体的一种方法。挤出器在使用时仅需要安装1片聚碳酸酯膜,操作简便;具有相对温和的操作环境;设备易清洗,适合灭菌,符合FDA和GMP制药卫生标准;脂质体制备稳定性与重现性好。
图3 脂质体挤出器
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王经理 |